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    細胞表面抗原-流式細胞檢測的一般步驟(供參考)

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    • 更新時間:2014-9-9 11:06:21

    1.實驗材料:檢測管或96微孔板 一抗(FITC標記),以表記Anti-CD19/FITC抗體為例 緩沖液:PBS(PH7.4) 設備:移液器、離心機、冰盒或冰箱、流式細胞儀

    2. 注意事項:標記抗體在使用之前用PBS溶解并振勻,并確認沒有沉淀,迅速離心幾秒,使所有的液體都集中到管底,標記抗體應避光4℃保存,避免凍結,因樣本的固定保存或較長時間放置可能會影響細胞表面分子和抗體之間的結合,故建議盡可能使用新鮮樣品。

    3. 操作方法: 一. 以大鼠淋巴組織細胞表面抗原的流式檢測步驟為例 樣品制備: 取出大鼠淋巴組織塊,迅速浸泡在10ml的緩沖液中,并用注射器的活塞研磨或使用兩塊預冷的載玻片研壓成單細胞。 把懸液轉移到50ml的錐形管中靜置片刻,使細胞團塊和碎片沉降到管底,并通過尼龍網過濾成單細胞懸液。 在4℃下300-400g離心4-5分鐘,除去上清液。 如果該樣品為脾臟細胞,加入一定量的RBC lysis裂解紅細胞,或者用分離液分離出淋巴細胞。若為其它樣品,不用此步驟。 加入50ml 緩沖液重懸細胞后計數,根據需要用臺盼藍(Trypan Blue)進行細胞活性檢測。 離心細胞液并除去上清;用適量的緩沖液重懸細胞為2×107個/ml。采用直接標記的一抗,則加入CD19/FITC抗體(0.5-1ug/106細胞)冰上孵育5-10分鐘。

    細胞熒光染色步驟:

    1. 在每個流式檢測管或板式微孔中加入50ul的稀釋后的一抗;在空白管/孔或同型對照管/孔中加入50ul 緩沖液。若進行抗體最佳濃度測試,建議范圍2-0.03ug/106細胞。

    2. 在各管/孔中分別加入50ul細胞懸液(約106細胞),并輕輕混勻。

    3. 避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。 (注意:有些抗體可能需要更長的孵育時間,建議實驗者進行預試驗摸索)

    4. 孵育完成后,加入緩沖液(每流式檢測管中加2ml,而每微孔中加200ul) 4℃下300-400g離心5分鐘,并棄去上清。

    5. 重復洗滌過程3次。

    6. 重懸細胞后上流式儀檢測。

    7. 使用直接標記一抗,用500ul 緩沖液重懸細胞后上機檢測。 若使用的一抗是純化或生物素標記抗體,則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標記二抗或熒光標記親和素(用緩沖液稀釋成合適的濃度)后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-30分鐘。洗滌細胞兩次(參考第4步和第5步方法)。之后500ul緩沖液重懸細胞,并上機檢測。

    8. 試驗結果分析:(注:若要對多個細胞表面抗原進行多色標記,則同時加入熒光標記抗體后按以上操作步驟進行孵育和細胞洗滌;操作盡量保持在避光和4℃左右的溫度下進行)

    二.以人外周血細胞表面抗原的流式檢測步驟為例

    1. 在每個流式檢測管或板式微孔中加入50ul的熒光標記或生物素標稀釋后的一抗(抗體用緩沖液稀釋成合適的濃度);在空白管/孔或同型對照管/孔中加入50ul 緩沖液。

    2. 每管分別加入100ul全血,并輕輕混勻。

    3. 避光孵育15-30分鐘。 (注:有些結合能力較低的抗體可能需要更長的孵育時間,建議實驗者進行預試驗摸索)

    4. 每管分別加入2ml RBC lysis Buffer(之前預熱恢復至室溫),混合均勻。

    5. 室溫避光孵育10分鐘,此孵育時間不要超過15分鐘。

    6. 室溫300-400g離心5分鐘,并棄去上清。

    7. 用2ml 緩沖液洗滌細胞一次。

    8. 重懸細胞后上流式儀檢測。

    9. 若使用的一抗是熒光直接標記抗體,用500ul 緩沖液或2%的多聚甲醛固定液重懸細胞后上機檢測。 若使用的一抗是純化或生物素標記抗體,則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標記二抗或熒光標記親和素(用緩沖液稀釋成合適的濃度)后于室溫避光孵育15-30分鐘。洗滌細胞1-2次(參考第7步方法)。之后500ul或2%的多聚甲醛固定液重懸細胞,并上機檢測。

    10. 試驗結果分析。 (注:若要對多個細胞表面抗原進行多色標記,則同時加入熒光標記抗體后按以上操作步驟進行孵育和細胞洗滌;操作盡量保持在避光條件下進行)

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